布鲁顿酪氨酸激酶（BTK）抑制剂在B细胞恶性肿瘤治疗中取得了突破性进展，显著改善了患者的临床预后。然而，部分患者在治疗过程中仍会出现耐药，限制了其长期疗效。现有研究表明，肿瘤微环境（TME）在BTK抑制剂耐药的形成中起着关键调控作用，但其具体机制尚不明确。在前期研究中，我们基于BTK抑制剂耐药患者来源的细胞，成功建立了套细胞淋巴瘤类器官模型。在本研究中，我们将借助该类器官模型，结合蛋白组学分析，系统筛选与BTK耐药相关的细胞因子和黏附分子，揭示TME信号在调控BTK耐药过程中的作用机制。进一步地，我们拟解析TME与B细胞淋巴瘤之间的相互作用网络，明确在耐药形成中发挥核心作用的信号通路。在此基础上，我们将尝试联合BTK抑制剂与靶向干预关键耐药分子，探索逆转耐药的新策略。本研究有望系统阐明TME在BTK耐药中的调控机制，为B细胞淋巴瘤耐药的转化治疗提供新的理论基础和可行的干预手段。

主要工作简历

正在承担的科研课题 (近5年)

布鲁顿酪氨酸激酶（BTK）抑制剂在B细胞恶性肿瘤治疗中取得了突破性进展，显著改善了患者的临床预后。然而，部分患者在治疗过程中仍会出现耐药，限制了其长期疗效。现有研究表明，肿瘤微环境（TME）在BTK抑制剂耐药的形成中起着关键调控作用，但其具体机制尚不明确。在前期研究中，我们基于BTK抑制剂耐药患者来源的细胞，成功建立了套细胞淋巴瘤类器官模型。在本研究中，我们将借助该类器官模型，结合蛋白组学分析，系统筛选与BTK耐药相关的细胞因子和黏附分子，揭示TME信号在调控BTK耐药过程中的作用机制。进一步地，我们拟解析TME与B细胞淋巴瘤之间的相互作用网络，明确在耐药形成中发挥核心作用的信号通路。在此基础上，我们将尝试联合BTK抑制剂与靶向干预关键耐药分子，探索逆转耐药的新策略。本研究有望系统阐明TME在BTK耐药中的调控机制，为B细胞淋巴瘤耐药的转化治疗提供新的理论基础和可行的干预手段。

（1）研究意义：

布鲁顿酪氨酸激酶（BTK）抑制剂在治疗B细胞恶性肿瘤中取得了革命性进展，显著延长了患者生存期。然而，获得性耐药的广泛发生，已成为限制BTK抑制剂长期疗效的主要障碍。目前的研究主要集中于肿瘤细胞自身的耐药机制，例如BTK或PLCγ2基因突变、信号旁路激活等；但对肿瘤微环境（TME）在驱动BTK抑制剂耐药中的作用认识有限，关键调控机制尚未明晰。近年来，临床观察和基础研究均提示，TME通过分泌细胞因子、重塑免疫抑制状态、促进肿瘤-基质细胞互作等多种途径，可能在BTK抑制剂耐药的发生和维持中发挥重要作用。尤其是在缺乏基因突变的耐药患者中，TME因素的贡献更值得重视。匹妥布替尼等第三代BTK抑制剂在部分耐药患者中恢复疗效，亦提示非突变机制在耐药形成中占据关键位置。深入解析TME如何介导BTK抑制剂耐药，不仅有助于识别高风险人群，实现精准用药和早期干预，更有望发现可靶向的外源性耐药机制，拓展联合治疗策略。本研究拟构建来源于BTK抑制剂敏感与耐药患者的套细胞淋巴瘤类器官模型，重建肿瘤细胞与其微环境的三维互作基础，结合蛋白组学技术系统筛选TME相关的耐药因子及信号通路，深入阐明TME诱导BTK抑制剂耐药的机制。研究成果将为开发以TME为靶点的联合治疗策略（如阻断关键细胞因子受体、破坏黏附分子介导的细胞互作、调节免疫抑制微环境等）提供理论基础和技术支撑，从而实现BTK抑制剂疗效的恢复与耐药的逆转，最终提升患者长期生存率和治疗获益。

（2）国内外研究现状：

1）新型BTK抑制剂在克服BTK突变导致的耐药方面取得积极进展，但仍存在耐药问题

布鲁顿酪氨酸激酶（BTK）抑制剂作为B细胞恶性肿瘤的靶向治疗核心药物，显著改善了慢性淋巴细胞白血病（CLL）和套细胞淋巴瘤（MCL）等患者的预后¹。然而，随着治疗时间的延长，BTK抑制剂的耐药问题日益突出，严重影响其长期疗效。为应对传统共价BTK抑制剂（如伊布替尼、泽布替尼）因BTK C481突变（特别是C481S）导致的获得性耐药，第三代非共价可逆性BTK抑制剂——匹妥布替尼（Pirtobrutinib）应运而生，显示出良好的耐药克服潜力²。在BRUIN全球研究中，匹妥布替尼在既往接受BTK抑制剂治疗的复发/难治性MCL患者中显示出50%–56.7%的客观缓解率（ORR），中位无进展生存期（PFS）为7.4个月，中位总生存期（OS）达23.5个月。在中国的JZNJ研究中，其在35例MCL患者中ORR为62.9%，中位PFS为6.8个月³⁴。尽管疗效显著，但临床实践中仍观察到匹妥布替尼耐药现象。BTK抑制剂的耐药机制可分为两类：原发性耐药和获得性耐药。⁵原发性耐药指治疗初期即无反应，通常与非遗传性机制相关，尤其是肿瘤微环境（TME）的保护作用。TME中的成纤维细胞、免疫细胞等通过分泌多种细胞因子（如IL-6、IL-10等）激活PI3K-AKT-mTOR、NF-κB等关键生存信号通路，绕过BCR通路屏障，造成BTK抑制剂的“无效”⁶。获得性耐药则常在治疗一段时间后出现，主要机制包括：1）BTK本身的突变（如C481S影响共价结合，T474I等守门突变）；2）BTK下游分子PLCG2的激活性突变；3）肿瘤克隆演化及继发遗传变异（如8p缺失、CARD11/BIRC3突变）；4）代谢途径重编程（如增强OXPHOS或谷氨酰胺代谢）；5）TME持续诱导促生存信号。尽管匹妥布替尼可克服C481突变，但耐药机制仍不断显现。目前研究报道，其耐药与BTK新突变（如V416L、A428D、M437R、T474I、L528W）及PLCG2突变密切相关⁷。然而，约30%的匹妥布替尼耐药患者并未检测到BTK或PLCG2变异，提示仍存在未明的、非突变驱动的耐药机制⁷。因此，解析BTK抑制剂尤其是非共价抑制剂的耐药机制，特别是TME介导的非遗传性耐药，已成为当前B细胞淋巴瘤研究的重要方向。识别关键TME耐药因子、并开发靶向其的联合治疗策略，是突破现有治疗瓶颈、改善患者预后的重要路径。

（2）TME在驱动BTK抑制剂耐药中的作用逐渐受到重视，但具体机制尚未明晰。

长期以来，B细胞淋巴瘤被认为是由恶性淋巴细胞克隆性增殖所致，其发病与进展主要归因于细胞内遗传和信号转导异常。然而，随着高通量基因组学和转录组学等技术的广泛应用，研究者逐渐认识到， TME在淋巴瘤的发生、演进和治疗反应中发挥着不可忽视的作用，其生物学复杂性远高于早期认知^8,9。2008年，Lymphoma/Leukemia Molecular Profiling Project (LLMPP) 研究首次在弥漫性大B细胞淋巴瘤（DLBCL）中识别出两种与预后密切相关的基质特征（stromal signatures）：stromal-1 相关于良好预后，富含细胞外基质和单核细胞浸润信号；而 stromal-2 关联于不良预后，富含内皮细胞及血管生成信号¹⁰。2021年，Leandro Cerchietti等进一步将DLBCL的微环境分为四种主要类型（LME亚型）：GC-LME、MS-LME、IN-LME 和 DP-LME，不同LME亚型在免疫状态、基质细胞富集程度和治疗反应上具有显著差异。其中，DP-LME 表现出最低的细胞外基质含量和最差的治疗预后¹¹。2025年，美国德州大学安德森癌症中心 Michael R. Green 团队通过单细胞多组学建立了大B细胞淋巴瘤的TME图谱（LymphoMAPs）（图1）¹²，进一步明确三种主要TME模式（LN、TEX、FMAC）在免疫状态及CAR-T反应中的预测价值，为淋巴瘤的精准免疫治疗提供了新方向。在BTK抑制剂治疗方面，越来越多的研究发现TME在耐药形成中发挥核心作用。Michael Wang 等将Cerchietti 的LME分类用于41例接受BTK抑制剂治疗的MCL患者分析，发现DP-LME亚型与治疗不敏感及预后不良显著相关。¹³细胞黏附介导的耐药（EMDR）是TME诱导药物耐受的关键机制之一。Jianguo 等研究表明，TME中的基质细胞（如成纤维细胞）可通过分泌CXCL12等细胞因子，激活肿瘤细胞表面的CXCR4和整合素VLA-4，启动PI3K-AKT-mTOR和NF-κB等生存信号通路，从而绕过BTK抑制剂对BCR通路的抑制，导致伊布替尼耐药⁶。此外，FAK在MCL患者的骨髓浸润区域中高表达，受转录因子SOX11调控，并通过SOX11/CXCR4/FAK轴促进MCL细胞迁移、黏附保护性微环境、逃避治疗并维持长期生存¹⁴。尽管上述研究为理解共价BTK抑制剂（如伊布替尼）耐药的TME机制提供了初步证据，但在新一代非共价BTK抑制剂（如匹妥布替尼）中是否存在相似或独立的TME相关耐药机制尚未明确。已有研究显示，约30%的匹妥布替尼耐药患者未检测到BTK或PLCG2突变⁷，提示TME可能在此类耐药中扮演更为重要的角色。因此，深入解析TME诱导BTK抑制剂（尤其是非共价类）耐药的机制，具有重要的研究意义和临床价值。一方面，有助于识别对BTK抑制剂原发或继发耐药的高风险TME特征患者，实现分层治疗与早期干预；另一方面，靶向TME中的关键促耐药信号，可能成为BTK抑制剂联合治疗和耐药逆转的有效策略。

图1. 淋巴瘤微环境原型图谱 (LymphoMAPs)。LymphoMAPs将在大B细胞淋巴瘤的微环境模式分为三类：1）LN模式：最接近正常淋巴结结构，富含能帮助抗肿瘤的T细胞；2）TEX模式：充满炎症环境，T细胞精疲力尽，巨噬细胞过度活跃；3）FMAC模式：T细胞很少，但充满成纤维细胞和促癌的巨噬细胞。（图片来自参考文献¹²）

（3）传统模型存在显著局限，已成为研究TME-BCL互作机制的关键瓶颈。

近年来，随着单细胞测序、空间转录组学和基质组学等前沿技术的发展，研究者逐步揭示了淋巴瘤组织中非肿瘤成分（如基质细胞、免疫细胞等）在疾病发生发展中的重要作用。然而，TME与B细胞淋巴瘤（BCL）之间复杂的互作机制尚未被充分解析，其中一个重要原因在于传统体外模型难以真实还原这一高度动态的细胞网络环境。传统的研究模型，如二维共培养体系，通常将基质细胞贴壁培养，失去了TME中关键的三维结构、物理张力与细胞外基质（ECM）信号¹⁵。这些模型不仅缺乏生理相关的机械刺激（如ECM硬度、拓扑结构、牵张力），也无法维持细胞间的空间互作与生化梯度，从而低估甚至误判了TME在信号转导与药物响应中的真实作用。此外，传统模型在TME组成方面存在严重简化，往往仅使用单一肿瘤细胞系，缺乏构建功能性TME所必需的多个核心要素：缺乏支持性基质细胞（如癌相关成纤维细胞、内皮细胞）；缺失关键免疫细胞群体（如T细胞、B细胞、巨噬细胞、NK细胞等）；缺乏功能性血管结构与趋化因子梯度。在此背景下，利用传统模型研究肿瘤如何重塑免疫抑制微环境、如何影响免疫细胞功能，或探讨免疫细胞如何反作用于肿瘤细胞，均面临极大挑战。这直接限制了我们对TME驱动BTK抑制剂耐药机制的深入理解，也阻碍了靶向TME的策略开发。

相比之下，类器官模型结合器官芯片技术为TME-BCL互作研究提供了理想的体外模拟平台。肿瘤类器官不仅保留了肿瘤细胞的遗传异质性和三维结构特征，还可通过优化共培养系统，实现与TME成分（如基质细胞、免疫细胞）的整合，构建更接近真实肿瘤组织的“类体内”环境。近年来发展的肿瘤免疫类器官更是进一步突破了传统局限，使研究T细胞浸润、免疫激活/衰竭状态、细胞因子分泌等免疫动态成为可能，有望成为探索BTK耐药机制及联合免疫治疗策略的重要工具。因此，建立模拟TME真实结构与功能的先进体外模型，尤其是整合TME多组分的类器官体系，对于深入解析BTK抑制剂耐药的非细胞自主机制、筛选关键耐药因子及验证干预靶点，具有重要的技术支撑意义与转化应用价值。

4）基于类器官模型复现TME-BCL互作，系统解析BTK耐药的微环境机制，筛选联合治疗靶点以实现耐药逆转。(本项目提出)

根据上述研究背景，可见解析TME介导BTKi耐药的机制、发现可联合干预的关键节点分子，是破解BTK耐药难题、实现精准治疗的关键。在前期研究中（见研究基础一），我们成功建立了匹妥布替尼耐药的原代B细胞淋巴瘤类器官模型，并在三维共培养系统中稳定复现了原发TME的细胞组成和功能特征，为微环境介导的耐药研究提供了可靠平台。下一步，我们将：（1）分析类器官模型中BCR信号通路激活状态，评估耐药过程中信号网络的异常激活（如BTK、SYK、PI3K、NF-κB等），揭示肿瘤细胞内在激活机制与TME信号之间的关联；（2）利用定量蛋白组学和分泌组学技术，系统鉴定与BTKi耐药相关的TME因子，包括免疫细胞分泌的细胞因子（如CXCL12、IL-6、IL-10）以及ECM蛋白（如fibronectin、laminin等），并结合生物信息学手段筛选可能的致耐药关键分子；（3）通过功能验证实验（如类器官再构、因子中和、基因沉默等），明确上述TME因子对B细胞存活、增殖和药物应答的调控作用；（4）基于机制研究，开展耐药逆转的联合用药筛选，如BTKi联合MALT1抑制剂、BCL2抑制剂或CXCR4拮抗剂等，寻找能协同干预TME-BCL互作、显著增强BTKi疗效的治疗组合，并在细胞与动物模型中进行验证。

综上所述，本研究聚焦BTKi耐药中“微环境-肿瘤细胞互作”这一关键但研究相对薄弱的领域，充分利用患者来源的类器官平台，结合系统蛋白组学和联合用药策略，力图揭示TME介导耐药的核心机制与可干预靶点。该研究不仅将拓展BTKi耐药机制的理论边界，填补免疫微环境调控网络的知识空白，更具重要转化价值，有望为临床提供切实可行的个体化联合治疗方案，最终提升B细胞恶性肿瘤患者的长期生存率和生活质量。

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研究内容：

1. 建立匹妥布替尼耐药的淋巴瘤类器官模型。（已完成）

在前期研究中，我们利用匹妥布替尼原发耐药患者的淋巴瘤组织、工程化基质细胞结合微阵列芯片制备了淋巴瘤类器官芯片，并利用高内涵成像对患者的前序治疗药物进行药效测试。建立了原发匹妥布替尼耐药的淋巴瘤类器官，利用H&E染色，流式细胞术对类器官模型进行表征，明确模型中多细胞成分的存在。通过基因测序鉴定无已报道的BTK基因突变，明确类器官模型的耐药是非基因突变引起的。同时建立匹妥布替尼敏感的淋巴瘤类器官，用于后续的机制挖掘。

2. 分析肿瘤类器官中BCR信号通路的激活情况。

对类器官中的BCR下游信号通路激活情况进行检测，重点关注关键信号蛋白如CD79a、BTK、AKT和ERK的磷酸化水平，以揭示其在BTK抑制剂耐药中的作用机制。通过使用BTK抑制剂（如匹妥布替尼）和PI3Kδ抑制剂进行干预，验证BCR信号通路对肿瘤细胞存活和耐药性的功能性影响。检测匹妥布替尼诱导肿瘤细胞凋亡，并抑制MCL在基质共培养下的生存和克隆形成能力，同时克服基质介导的耐药性的能力。明确TME/基质是否通过"由外向内"信号触发持续的BCR-BTK-ERK-AKT通路激活，促进MCL生存/耐药。

3. 利用蛋白组学分析淋巴瘤类器官模型中调控BCL对BTK耐药的细胞因子和ECM蛋白。

获得匹妥布替尼敏感/耐药淋巴瘤类器官后，通过Luminex多因子技术对培养上清中的细胞因子区划因子进行比对，挑选差异表达前3-5的细胞因子进行分子抑制剂干或基因沉默，明确发挥关键作用的细胞因子。通过蛋白组学技术对基质组检测，结合MatrixDB数据库进行分析，获得对激活BCR通路，维持淋巴瘤存活其关键作用的ECM蛋白。挑选差异表达前3-5的ECM成分进行干预。

对我科室历史收到的匹妥布替尼有效和无效的患者样本进行RNA-seq测序结果的分析（10~20例），验证本研究发现的靶点是否在临床标本中也与匹妥布替尼有效性相关。

4. 靶向介导耐药的关键节点分子和BTK抑制剂连用，建立逆转BTK耐药的新策略。

在体外模型中，将靶向本研究发现的细胞因子和ECM蛋白及相关信号通路蛋白药物与匹妥布替尼进行联合使用，评估联合疗法对于BCL细胞的杀伤作用。建立匹妥布替尼耐药的动物模型，在动物模型上验证疗法的有效性,为转化研究提供支持。

研究目标：

1. 解析BTK耐药的淋巴瘤类器官模型中调控BCL对BTK耐药的细胞因子和ECM蛋白。
2. 为BTK抑制剂联合靶向TME药物的联合提供转化研究方向。

拟解决的科学问题：

1. 为BTK耐药患者筛选出合适的联合方案，解决BTK单药治疗的局限性；
2. 解析肿瘤微环境中驱动BTK耐药过程的关键因子，为BTK耐药患者寻找潜在的作用靶点。

研究方法：

1. 利用工程化细胞技术、微阵列芯片技术，构建匹妥布替尼原发耐药和敏感患者来源的淋巴瘤类器官芯片，用于研究肿瘤微环境介导的匹妥布替尼原发耐药。

（1）匹妥布替尼原发耐药和敏感患者的组织获得与处理。

1. 从本科室手术病人中留取2-3名匹妥布替尼初次治疗无效的BCL患者的肿瘤组织块，以及2-3名后续方案中初次使用匹妥布替尼治疗效果良好的BCL患者的先前收集的肿瘤组织块。
2. 处理肿瘤组织块，去除组织块上的坏死组织、肌肉、结缔组织和脂肪组织。将组织块剪成多个小块，取2-3块冻存，以备后续病理分析及测序分析。
3. 剩余组织块尽可能剪碎，收集剪碎过程中掉落的细胞。
4. 无法继续剪碎的组织加入含胶原酶IV和DNA酶的消化液并置于摇床，37℃消化15min，吹打收集单细胞上清液，重复三次。
5. 将所有收集的单细胞悬液离心并冻存，同时留取一部分细胞用于后续患者来源淋巴瘤类器官的构建。

（2）工程化基质细胞MRC5-LB的构建。

1. 取对数生长期的人胚肺成纤维细胞MRC5细胞接种于6孔板并培养至70-80%融合度。
2. 分别用携带CD40配体（CD40L）、B-细胞激活因子（BAFF）基因和绿色荧光蛋白（GFP）的慢病毒感染细胞，加入聚凝胺增强感染效率，37℃孵育12-16小时。
3. 去除含病毒的培养基，更换新鲜完全培养基，继续培养48小时。
4. 加入嘌呤霉素筛选稳定转染细胞，每2-3天换液，持续10-14天。
5. 采用有限稀释法将存活细胞接种于96孔板，培养2-3周，挑取单克隆扩大培养。
6. 通过qPCR检测CD40L和BAFF的mRNA水平，流式细胞术或Western blot检测蛋白表达。

（3）淋巴瘤类器官芯片的构建。

1. 利用3D打印的微孔制作模具和低熔点琼脂糖溶液在超薄玻璃底96孔板中制作琼脂糖类器官培养微阵列。
2. 胰酶消化足够量的MRC5-LB细胞并用Countstar自动计数仪进行细胞计数和细胞活性分析，同时对先前准备好的匹妥布替尼耐药或敏感淋巴瘤患者来源肿瘤组织的单细胞悬液进行细胞染色以及细胞计数和细胞活性分析。
3. 按患者来源肿瘤细胞：MRC5-LB细胞=9：1的比例配制成细胞混合液，加入96孔板微孔阵列中培养以形成匹妥布替尼耐药和敏感的淋巴瘤类器官。
4. 利用淋巴瘤类器官结合高内涵成像技术进行临床用药测试，将成像数据转换为药物敏感数据，并将药物测试结果与临床患者用药效果进行对应，以验证所构建的淋巴瘤类器官的模型优越性。

（4）所构建的淋巴瘤类器官模型的全面表征。

1. 取构建的匹妥布替尼耐药和敏感的淋巴瘤类器官进行H&E染色，并与对应的留存患者的肿瘤组织块进行对比。
2. 取构建的匹妥布替尼耐药和敏感的淋巴瘤类器官并消化为单细胞悬液以进行流式细胞术，明确类器官模型中存在的多细胞成分。
3. 取构建的匹妥布替尼耐药和敏感的淋巴瘤类器官进行基因测序鉴定有无已报道的BTK基因突变，明确类器官模型的耐药是由非基因突变引起。

2. 利用转录组测序、磷酸化组学技术、Western Blot技术，分析淋巴瘤类器官中BCR信号通路的激活，以及类器官模型中匹妥布替尼对BCR信号通路及淋巴瘤细胞表型的影响。

（1）检测淋巴瘤类器官BCR下游信号分子磷酸化的影响。

1. 利用Illumina进行转录组测序，对比匹妥布替尼耐药和敏感淋巴瘤类器官中BCR下游信号分子（如CD79a、BTK、AKT、ERK）的基因表达水平。
2. 利用LC-MS/MS对比匹妥布替尼耐药和敏感淋巴瘤类器官中BCR下游信号分子（如CD79a、BTK、AKT、ERK）的蛋白产物的磷酸化水平，MaxQuant数据库进行搜索，Ascore算法进行磷酸化位点验证，KEGG以及PhosphoSitePlus进行功能注释。
3. Western Blot实验对比匹妥布替尼耐药和敏感淋巴瘤类器官中BCR下游信号分子（如CD79a、BTK、AKT、ERK）的磷酸化蛋白质产物水平。

（2）BTK抑制剂和PI3Kδ抑制剂验证BCR信号的功能。

利用（1）中的方法，即转录组测序、磷酸化蛋白质组学以及Western Blot实验，对比分析分别使用BTK抑制剂（匹妥布替尼）和PI3Kδ抑制剂（艾德拉尼、林普利赛）处理匹妥布替尼耐药和敏感淋巴瘤类器官对其中BCR下游信号分子（如CD79a、BTK、AKT、ERK）的影响。

（3）检测匹妥布替尼对耐药以及敏感淋巴瘤类器官表型和信号通路的影响。

1. 利用免疫荧光染色、流式细胞术检测匹妥布替尼对耐药以及敏感淋巴瘤类器官中肿瘤细胞的死活，克隆形成实验检测BCL在与基质细胞共培养时的克隆形成能力，同时与去除基质细胞后BCL死活、克隆形成能力和匹妥布替尼敏感性做对比。
2. 整合分析BCR信号通路相关分子的变化，明确TME/基质通过"由外向内"信号触发持续的BCR-BTK-AKT-ERK通路激活，促进BCL生存和耐药。

3. 利用蛋白质组学技术，分析BTK耐药的淋巴瘤类器官模型的TME中调控BCL对BTK耐药的细胞因子和ECM蛋白。

（1）检测并验证与匹妥布替尼耐药相关的细胞因子和趋化因子。

1. 利用Luminex多因子技术全面检测匹妥布替尼耐药和敏感淋巴瘤类器官培养上清中的细胞因子和趋化因子（如IL-6、CXCL12、TGF-β、CCL2），并进行比对分析。
2. 挑选差异表达前3-5的细胞因子或趋化因子。
3. 利用相对应的分子抑制剂干扰特定细胞因子或趋化因子的表达或通过基因沉默抑制相应基因的表达之后，检测类器官中肿瘤细胞的死活以及匹妥布替尼敏感性，进一步明确发挥关键作用的细胞因子或趋化因子。

（2）检测并验证与匹妥布替尼耐药相关的ECM蛋白。

1. 通过蛋白质组学技术对匹妥布替尼耐药和敏感淋巴瘤类器官以及对应的肿瘤组织样本的基质组进行检测，结合MatrixDB数据库进行分析，获得对激活BCR通路，维持BCL存活起关键作用的ECM蛋白（如纤维连接蛋白、层粘连蛋白、胶原蛋白、腱生蛋白-C、玻连蛋白）。
2. 挑选差异表达前3-5的ECM成分。
3. 利用ECM相关蛋白所在通路的抑制剂进行干预，检测类器官中肿瘤细胞的死活以及匹妥布替尼敏感性，进一步明确发挥关键作用的ECM成分。

（3）患者样本RNA-seq测序结果分析。

选取10-20例我科室历来收到的匹妥布替尼有效和无效的患者样本进行RNA-seq测序结果的分析，验证本研究发现的靶点是否在临床标本中与匹妥布替尼有效性相关，并进一步筛选得到最优的药物联用靶点。

4. 利用类器官模型、动物模型，验证靶向TME介导耐药的关键节点分子同BTK抑制剂联用的效果，探索药物联用新策略逆转BTK耐药的临床转化潜力。

（1）利用淋巴瘤类器官模型评估联合疗法对于BCL细胞的杀伤作用。

1. 针对筛选的药物联用靶点选择相应的抑制剂作为匹妥布替尼的联用药物。
2. 利用建立的匹妥布替尼耐药淋巴瘤类器官结合高内涵成像技术，检测并对比药物联用和单药使用时BCL细胞的死活，评估针对TME新靶点的联合疗法在逆转匹妥布替尼耐药方面的效果。

（2）建立匹妥布替尼耐药的动物模型并验证联合用药的效果。

1. 将患者来源的匹妥布替尼耐药细胞皮下接种至免疫缺陷小鼠，构建匹妥布替尼耐药PDX模型（每组5-8只）。
2. 利用建立的耐药PDX模型，监测并对比药物联用和单药使用时的肿瘤生长曲线，进一步评估针对TME新靶点的联合疗法在逆转匹妥布替尼耐药方面的效果。

技术路线:

图2.本项目技术路线图。

可行性分析：

1.所在团队具有丰富的临床资源和临床工作基础:

北京大学肿瘤医院淋巴瘤科是国内成立最早的淋巴瘤专业科室之一，长期从事恶性淋巴瘤的临床和科研工作，对恶性淋巴瘤有着深刻的理解和丰富的诊断治疗经验。目前正在开展的国际和国内新药临床试验共四十余项，是国内淋巴瘤领域开展临床研究最多的科室。

2.项目申请人具有良好的肿瘤微环境相关研究基础

申请人长期致力于肿瘤微环境响应型生物材料设计的研究。在国家纳米科学中心纳米生物效应与安全性重点实验室攻读博士学位期间，申请人设计了MMP酶响应型脂质体(ACS Nano 2017)、肿瘤相关成纤维细胞靶向型多肽基因载体（ACS Nano 2019）、肿瘤酸响应型多肽-Fc偶联物（Adv. Mater. 2019）、肿瘤表面CXCR4靶向多肽偶联化疗药物（Acta Pharm. Sin. B 2023）等多个递送系统，具有较高的生物材料研发能力，特别擅长功能性多肽的设计。在康奈尔大学化工系进行博士后研究期间，申请人发表多篇水凝胶，聚合物材料方向的文章（AIChE J. 2021，Sci. Adv. 2022）。这些都为本研究的顺利开展提供了坚实的基础。

3.项目申请人依托的临床科室和实验平台可行

本项目依托北京肿瘤医院淋巴瘤科室、临床实验室、中心实验室和北京大学国际癌症研究所实验平台，包含有细胞和分子生物学实验室，动物饲养间，同时申请人常年保持和国家纳米科学中心的合作，该中心有完善的生物材料制备和力学生物学性质表征平台，以上平台可为本项目的顺利实施提供坚实的硬件保障和实验技支撑。

1. 首创淋巴瘤类器官-TME动态耐药模型。

利用淋巴瘤类器官模型进行EMDR相关的耐药研究。本研究首次构建了 "淋巴瘤患者来源类器官整合肿瘤微环境的动态EMDR演化模型"，直击环境因素诱导耐药的核心机制。

2.从肿瘤微环境角度解析BTK耐药机制催生联合治疗策略的转化研究。

传统BTKi耐药研究聚焦于肿瘤细胞自身的BTK突变（如C481S、T474I、L528W等）或BCR通路适应性改变，而TME视角揭示：非遗传性耐药机制：如TME通过物理屏障（如ECM）、免疫抑制细胞（Treg、M2型巨噬细胞）及细胞因子（IL-10、TGF-β）庇护肿瘤细胞，削弱BTKi渗透性与效力；代谢适应性：TME中缺氧与酸环境诱导淋巴瘤细胞代谢重编程，通过上调抗凋亡蛋白（BCL-XL、MCL-1）抵消BTKi促凋亡效应等新视角。通过对TME中信号通路的发掘为联合治疗的临床试验提供候选药物。

1.解析BTK耐药过程中TME-BCL的互作网络，绘制淋巴瘤TME诱导耐药的细胞-因子互作图谱。

2.鉴定≥2个TME依赖性耐药靶点（如IL-6R/JAK-STAT、CXCL12/CXCR4）。

3.提出1种基于TME重塑的BTK抑制剂联合治疗淋巴瘤方案。

1. 申请人已建立了匹妥布替尼耐药的淋巴瘤类器官模型。

目前肿瘤类器官常使用基质胶培养，基质胶能够提供为类器官形成三维支架和营养，但基质胶中的类器官生长位置随机，不利于高内涵成像聚焦，并且基质胶中的类器官大小不一，用药后对类器官的评价基线不一致，导致类器官药效评价困难。因此我们设计了一种3D打印的琼脂糖成型模具，在96孔板中浇铸琼脂糖微阵列（ 3×3 ），一个孔中可以形成9个直径500 μm的小孔，接种细胞后，细胞可以相对均匀地沉降于9个小孔中，如图A（上）所示，用该方法构建的类器官大小均匀，位置相对固定，基质细胞在类器官中心聚集成团，淋巴瘤细胞与基质细胞结合，形成类器官球。如图A（下）所示，类器官可以在原位进行活死染色，基质细胞表达绿色荧光蛋白，与基质细胞结合紧密的淋巴瘤细胞活力较好，仅有少量散在的淋巴瘤细胞死亡，表明该模型可以用于后续高内涵成像分析类器官评价药物作用效果。

我们利用琼脂糖微阵列成功构建了一例套细胞淋巴瘤类器官（MCL PDO），并进行了药物测试。如图B所示，我们使用该例类器官进行匹妥布替尼的药效检测，染色后进行高内涵成像，采集明场图像和GFP、PI、Hoechst的荧光图像，计算PI和Hoechst总荧光强度的比值，用于表示药物对类器官的杀伤。如图C所示，PI/Hoechst Int. Den表示PI和Hoechst的总荧光强度比值，与对照组相比，匹妥布替尼对该套细胞淋巴瘤患者的类器官没有显著的杀伤。

图3.一例基于琼脂糖微阵列的套细胞淋巴瘤类器官的构建和药效评价。（A） 3×3琼脂糖微阵列构建的淋巴瘤类器官。蓝色：Hoechst，红色：PI，绿色：绿色荧光蛋白。标尺，1 mm（上），200 μm（下）。（B）高内涵成像分析仪拍摄的匹妥布替尼作用于套细胞淋巴瘤类器官荧光重叠图像。蓝色：Hoechst，红色：PI，绿色：绿色荧光蛋白。标尺，500 μm （C）不同浓度匹妥布替尼作用于淋巴瘤类器官的PI和Hoechst总荧光强度比值统计图。

申请人所在的科室为北京大学肿瘤医院淋巴肿瘤科，在恶性淋巴瘤的基础、临床转化及新药临床试验研究方面均具有丰富经验及扎实的前期工作积累：1）课题组自 2012 年起即围绕 BCR 信号传导通路及Btk 抑制剂开展大量的基础及临床转化研究工作，获国家、科技部、北京市基金项目资助 10余项，牵头开展各类型 Btk 抑制剂临床试验项目 9 项，在 Cell Research、Leukemia 及 Clinical Cancer Research 等顶级期刊发表 SCI 论文 30 余篇。

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